Очередной (44-й) пост моего блога на портале "MedBook.ru"

СЕНЬОР БЕЛЬМОНТЕ ТОЖЕ УВАЖАЕТ МЕЙОЗ

Часть вторая: ТЕХНОЛОГИЯ

Итак, целью объединённой команды Бельмонте и Миталипова было редактирование генома клеток человека. Этим термином обозначается новая технология генной инженерии - технология второго этапа ее развития.

1. Впервые о генной инженерии громко заговорили в семидесятых годах прошлого века. Это было связано с открытием у бактерий системы рестрикции-модификации ДНК (о которой я кратко рассказывал в посте от 27.05.2017). 

Она выполняет функцию простейшей иммунной системы: а именно, помечает метильными группами определённые сайты своей ДНК и разрывает чужеродные ДНК, не метилированные по данным сайтам.

Разрыв осуществляется сайтспецифичными ферментами, которых назвали рестриктазами. Последние и послужили главным инструментом генной инженерии: с их помощью стало возможным вырезать из молекул ДНК практически любые фрагменты, чтобы потом вставить их в ту или иную конструкцию.

2. Позже, примерно через два десятилетия, у микроорганизмов обнаружили еще одну (правда, представленную в очень разнообразных вариантах), более сложную систему с аналогичной иммунной функцией.

Принцип ее действия состоит в том, что в клетке, удачно перенесшей вторжение чужеродной ДНК (например, в составе бактериофага), специально сохраняются некоторые короткие фрагменты этой ДНК.

Для этого они вставляются в состав собственной ДНК бактерии - в особой области, между короткими повторяющимися последовательностями нуклотидных пар. Эти фрагменты (теперь ставшие спейсерами) постоянно с небольшой скоростью транскрибируются.

Транскрипты (короткие РНК) связываются со специальными белками и "патрулируют" внутриклеточное пространство. Если в клетке вновь оказывается та же чужеродная ДНК, то теперь она разрушается гораздо быстрее, чем в первый раз.

Это происходит благодаря тому, что одна из "патрульных" РНК находит в ДНК комплементарную последовательность, связывается с ней, после чего белки-спутники РНК вызывают в ДНК многочисленные одно- или двуцепочечные разрывы.

3. Нетрудно видеть, что принцип работы этой внутриклеточной иммунной системы (у бактерий!) практически такой же, как у иммунной системы сложных организмов. Так, например, короткие "патрульные" РНК подобны по функции В- и Т-клеткам памяти, а белки-спутники - макрофагам.

4. И вот открытие этой второй внутриклеточной иммунной системы дало генной инженерии совершенно новую - сложную, но весьма эффективную - технологию.

Последняя обозначается неудобоваримой аббревиатурой CRISPR-Cas, расшифровку которой я опущу (затраты времени на это, думаю, не стоили бы вскрывающегося смысла). И далее буду использовать русское полужаргонное название - "Криспер-технология" или просто "Криспер".

С помощью этой процедуры во внутриядерной ДНК можно найти, например, мутантный участок, вырезать его и образовать на его месте нормальный, бездефектный .

Но для этого необходимо, чтобы в клетке с дефектным гЕном появились соответствующие "детали", составляющие чудо-агрегат:

А) РНК, комплементарная дефектному гену, 

Б) соответствующий белок, который вносил бы разрывы в участок ДНК, маркированный "дефектспецифичной" РНК,

В) матрица, кодирующая нормальную последовательность нуклеотидных пар, которая должна появиться на месте разрушенного участка ДНК.

5. После этого введения обратимся к работе, произведшей СОБЫТИЕ.

 Редактированию подвергался ген MYBPC3, точнее, его мутантный вариант (MYBPC3-mut), лишенный в одном из локусов четырёх нуклеотидных пар. Нормальный ген кодирует один из мышечных белков кардиомиоцитов.

Указанная мутация этого гена передаётся по наследству и даже в гетерозиготном состоянии вызывает миокардиопатию.

Для исследования брали ооциты II здоровых женщин и клетки больных мужчин, гетерозиготных по данной мутации.

А) Сперматозоиды пациентов использовались для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) указанных ооцитов, в результате чего дефектный ген оказывался в зиготе и затем (при культивировании) - в тех или иной клетках эмбрионов, развивающихся из зигот.

Б) Фибробласты кожи больных мужчин подвергались перепрограммированию в т. н. иПСК (индуцированные полипотентные стволовые клетки). Примерно половина этих клеток тоже содержала мутантный ген.

6. Основное экспериментальное воздействие состояло в том, что в названных клетках инициировалось появление (или образование) полного комплекса факторов, необходимых для редактирования мутантного гена MYBRC3-mut. 

Причем, важно отметить, что для одних клеток это делалось одним, а для других клеток - другим способом.

А) I. В случае иПСК информацию о всех компонентах редактирующего комплекса предварительно кодировали в ДНК и встраивали последнюю в плазмиду - удобное средство для транспорта ДНК внутрь клеток.

II. Плазмиду можно ввести в клетку разными способами; в данной работе использовали электропорацию, которая сочетает слабую вибрацию и электроимпульсы.

III. В клетке же транскрипция плазмиды приводила к образованию всех компонентов и их сборке в единый агрегат, который приступал к выполнению своей миссии.

Б) Во втором массиве экспериментов непосредственными объектами, в которых искусственно создавали аналогичный редактирующий комплекс, служили, условно говоря, преэмбриональные клетки - ооциты II и зиготы. 

Напомню: ооциты II от здоровых женщин подвергались процедуре ЭКО со сперматозоидами больных мужчин, гетерозиготных по редактируемой мутации.

Так вот, в этих случаях, в связи с большими размерами клеток, обходились без плазмид: в цитоплазму соответствующей клетки (ооцита II или зиготы) просто впрыскивали пипеткой уже готовые компоненты редактирующего комплекса. 

В первом случае комплекс вводили в клетку одновременно со сперматозоидом; во втором случае - во время подготовки зиготы к первому делению дробления, а именно в период удвоения ДНК и хромосом.

7. Итак, в иПСК и в преэмбриональных клетках появлялся РНК-белковый комплекс, способный к исправлению мутации гена MYBRC3.  

А затем исследователи с помощью секвенирования ДНК определяли результаты работы комплекса. 

Но об этом - уже в следующем сообщении .